ADN antiguo re

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13635 (2023) Citar este artículo

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La paleogenómica está contribuyendo a perfeccionar nuestra comprensión de muchos acontecimientos evolutivos importantes a una resolución sin precedentes, con impactos relevantes en varios campos, incluida la filogenética de especies extintas. Hasta ahora se han caracterizado a nivel de ADN pocas especies animales existentes y extintas de las regiones mediterráneas. El pika sardo, Prolagus sardus (Wagner, 1829), fue una especie lagomorfa icónica que pobló Cerdeña y Córcega y se extinguió durante el Holoceno. Existe un cierto debate científico sobre la asignación filogenética del género extinto Prolagus a la familia Ochotonidae (una de las dos únicas familias existentes del orden Lagomorpha) o a una familia separada Prolagidae, o a la subfamilia Prolaginae dentro de la familia Ochotonidae. En este estudio, reconstruimos con éxito una porción del mitogenoma de un pika sardo que data del Neolítico y se recuperó de la cueva de Cabaddaris, un sitio arqueológico en Cerdeña. Nuestra filogenia calibrada puede respaldar la hipótesis de que el género Prolagus es un grupo hermano independiente de la familia Ochotonidae que se separó del linaje del género Ochotona hace unos 30 millones de años. Estos resultados pueden contribuir a refinar la interpretación filogenética de las peculiaridades morfológicas del género Prolagus ya descritas por estudios paleontológicos.

Los estudios sobre el ADN antiguo (ADNa) de especies animales extintas han permitido profundizar en el pasado y complementar los enfoques paleontológicos clásicos para reconstruir trayectorias evolutivas a un nivel sin precedentes1,2,3,4,5,6. En particular, el ADN mitocondrial (ADNmt) representa una herramienta útil para comprender la filogenia y la dinámica poblacional debido a su abundancia en restos antiguos con respecto al genoma nuclear, su alta tasa de mutación y su modo de evolución casi neutral7,8,9,10,11. 12.

Hasta ahora se han caracterizado a nivel de ADN algunas especies animales extintas de las regiones mediterráneas, lo que proporciona información sobre la historia evolutiva única de especies aisladas y endémicas3,4,7,13,14,15,16. Un interesante estudio de caso se basa en una especie extinta de Cerdeña. Los datos paleogenómicos relacionados con el enigmático extinto dhole sardo, Cynotherium sardous Studiati, 1857, demostraron que esta especie de cánido única, que pobló la isla hasta finales del Pleistoceno tardío, representa un taxón separado de todos los demás cánidos vivos y quedó genéticamente aislado de otros. Linajes de cánidos continentales aproximadamente entre 500 y 300 kya (Pleistoceno medio)4.

Otra especie extinta enigmática e icónica que pobló Cerdeña y Córcega es la pika sarda Prolagus sardus (Wagner, 1829)17,18,19. El género Prolagus Pomel, 1853, que pertenece al orden Lagomorpha, está documentado por varias especies que vivieron durante el Neógeno y el Cuaternario19,20,21. Se han identificado fósiles pertenecientes a este género en muchos sitios de Europa, el norte de África y Anatolia. La historia evolutiva y la anatomía de Prolagus han sido discutidas por varios autores que tradicionalmente consideraban a este género como un miembro peculiar de la familia Ochotonidae Thomas, 189720,21,22,23,24,25,26,27,28,29, que Actualmente incluye sólo los pikas vivos, todos clasificados dentro del género Ochotona Link, 1795. Sin embargo, algunos otros autores han propuesto que todas las especies extintas de Prolagus pertenecen a la familia separada Prolagidae Gureev, 1964, o alternativamente a una subfamilia de Ochotonidae, Prolaginae23 ,24,25,26,27,28. La falta del tercer molar inferior (M3) es uno de los principales elementos anatómicos que diferencia a las especies Prolagus del género Ochotona20,30. Se cree que Prolagus se derivó anagenéticamente del género monoespecífico Piezodus Viret, 1929, un taxón del Oligoceno-Mioceno inferior de Europa, que se diferencia de Prolagus por la presencia de muelas enraizadas y metafléxidos, y la falta de protoconúlido en el tercer tercio. premolar inferior20,21,31,32. Se sabe que las especies de Prolagus están presentes en ambientes insulares mediterráneos, como lo documentan los taxones recuperados en el paleoarchipiélago de Gargano (¿Mioceno tardío? - Plioceno temprano) y en el Bloque Cerdeña-Córcega (Plioceno tardío - Holoceno). En Córcega y Cerdeña, el género Prolagus está representado por un linaje anagenético que incluye tres taxones endémicos: Prolagus aff. figaro (Plioceno tardío temprano de Capo Mannu D1), Prolagus figaro López-Martínez, 1975 (¿Plioceno más reciente?/Plioceno más temprano—Plioceno temprano tardío) y Prolagus sardus (Wagner, 1829) (Plioceno medio—Holoceno)17,20,32, 33,34,35,36.

Entre los restos fósiles de vertebrados cuaternarios de Cerdeña, los de Prolagus sardus son sin duda los más abundantes37,38,39,40,41,42,43,44. Es probable que P. sardus fuera presa de varios carnívoros (cánidos y mustélidos) y aves rapaces del paleoecosistema insular del Cuaternario de Córcega y Cerdeña. En particular, parece posible que el cánido endémico Cynotherium sardous estuviera especializado en cazar P. sardus45,46. Los restos quemados recogidos en varios sitios arqueológicos documentan que P. sardus fue cazado y consumido regularmente por las primeras comunidades de humanos modernos que colonizaron el Bloque Cerdeña-Córcega39. Este lagomorfo estuvo seguramente presente en Cerdeña hasta la Edad del Hierro (s. XIV, 2760 cal BP según el yacimiento de la cueva de Su Guanu) y en Córcega posiblemente hasta la época romana (entre el 2343 a. C. y el siglo VI d. C. según el yacimiento de Castellu). 37,38,39,47,48. Sin embargo, la extinción de P. sardus probablemente esté relacionada con la introducción de nuevos depredadores y competidores ecológicos en el ecosistema insular. La transmisión de patógenos por especies introducidas como ratas y liebres no puede excluirse como posibles eventos alternativos o coeventos que llevaron a la extinción de esta especie37,38,39.

En este estudio, informamos la recuperación de secuencias del genoma mitocondrial de P. sardus derivadas de una muestra de hueso datada con radiocarbono recolectada en un sitio arqueológico de Cerdeña. Las reconstrucciones filogenéticas basadas en estas secuencias de ADN pueden sugerir que el género extinto Prolagus podría ubicarse mejor en un grupo hermano independiente de la familia Ochotonidae.

El hueso analizado (espécimen n. PR6) era una hemimandíbula izquierda incompleta perteneciente a un pika sardo maduro recolectado en la cueva de Cabaddaris (Cerdeña, Italia; Fig. 1). Las dimensiones de la hemimandíbula y las características dentognáticas, como las características generales de P3, la ausencia de M3 y la presencia de tres lóbulos en M2, permitieron claramente asignar el hueso a P. sardus y excluir a todos los lagomorfos sardos vivos y extintos.

a) Ubicación geográfica de la cueva de Cabaddaris (Cerdeña, Italia); (b) hemimandíbula izquierda de Prolagus sardus (hueso PR6) utilizada para la extracción de ADN y la datación por radiocarbono, desde diferentes perspectivas (b1: bucal, b2: oclusal, b3: lingual y b4: vista oclusal de los dientes de la mejilla); (c) esqueleto compuesto de P. sardus (Museo Sardo di Geologia e Paleontologia “D. Lovisato”, Universidad de Cagliari); (d) reconstrucción paleoartística de P. sardus (dibujo de D. Zoboli).

La datación por radiocarbono realizada con el método de espectrometría de masas con acelerador (AMS) indicó un rango calibrado de 7575 a 7431 cal BP con una probabilidad del 95,4% (material complementario, figura S1). Este resultado atribuyó el hueso analizado al Neolítico (del 6000 al 4000 a. C.).

Se aplicaron los protocolos más sensibles y de última generación para el análisis de ADNa y se evaluó la eficiencia del análisis en cada paso. Se generaron más de 32 millones de lecturas de extremos pareados a partir del espécimen PR6, pero solo una fracción extremadamente baja de todas las secuencias obtenidas (0,008%) se mapeó contra el genoma mitocondrial de referencia de Ochotona curzoniae (número de acceso: NC_011029.1), lo que indica una conservación deficiente del ADNa. de este ejemplar.

Las secuencias que se asignaron a los genomas de referencia mitocondriales de O. curzoniae informaron patrones típicos de ADN degradado, como longitud corta de los fragmentos (40 pb en promedio) y frecuencia creciente de transiciones C > T en las posiciones más extremas de cada lectura (Material complementario Figura S2). Teniendo en cuenta los resultados de la alineación de estas lecturas, la fracción más alta de lecturas se mapeó en los genomas mitocondriales de O. curzoniae (NC_011029.1), O. princeps (NC_005358.1) y Oryctolagus cuniculus (NC_001913.1), con 2721, 2608 y 2535 lecturas asignadas únicas (después de filtrar duplicados), respectivamente.

Se obtuvo un total de 3.393 pb con patrones claros de daño en el ADN antiguo, correspondientes a un 19,8% del genoma mitocondrial completo de P. sardus, si se hace referencia a la secuencia de referencia mitocondrial moderna del ochotónido O. curzoniae (17.131 pb). La distribución de las secuencias obtenidas a lo largo de este genoma mitocondrial de referencia se muestra en el material complementario, figura S3.

La alineación de las lecturas con la secuencia de ADNmt de referencia de O. curzoniae produjo un total de 51 regiones de consenso, de las cuales 12 tenían más de 100 pb (Material complementario, Tabla S1). En particular, al combinar información de secuencia, para cinco genes mitocondriales y para el bucle D, los datos de secuencia tenían más de 100 pb (Material complementario, Tabla S2). La Figura 2 muestra la reconstrucción de contigs de ADNmt de P. sardus que coincidían con las regiones correspondientes de la secuencia de ADNmt de O. curzoniae.

Regiones de consenso de ADNmt de Prolagus sardus (círculo interior) alineadas con la secuencia completa de ADNmt de Ochotona curzoniae. Aquí solo se informaron regiones de más de 100. Las regiones en rojo corresponden a secuencias de ADNmt de P. sardus utilizadas para análisis filogenéticos; en cambio, las regiones en azul no se consideraron. Para simplificar la representación gráfica, las características del ARNt no se incluyeron en la secuencia de referencia.

Se construyeron árboles filogenéticos utilizando la información de secuencia obtenida de P. sardus y de 18 genomas mitocondriales de especies de lagomorfos existentes (ocho de Ochotonidae y diez de Leporidae). El genoma mitocondrial de la especie de roedor Cricetulus griseus se utilizó como grupo externo (material complementario, Tabla S3). Para evitar sesgos derivados de regiones de ADNmt demasiado cortas, fragmentadas y no informativas, se llevaron a cabo análisis filogenéticos con alineamientos que incluían las regiones informativas de las secuencias 12S, 16S y D-loop o a partir de una secuencia combinada que incluía solo las regiones 12S y 16S. Todas las secuencias codificantes consideradas no tenían mutaciones de desplazamiento del marco de lectura (inserciones/deleciones) ni mutaciones sin sentido (codones de terminación). Incluyendo otras secuencias, los resultados no cambiaron (datos no mostrados). En todos los árboles filogenéticos reconstruidos, P. sardus era un taxón externo a todos los Ochotonidae, lo que indica que puede representar un taxón hermano del grupo ochotonid (Fig. 3). Los árboles de inferencia de máxima probabilidad del genoma mitocondrial parcial de las secuencias derivadas de huesos de P. sardus establecieron inequívocamente que esta especie extinta está más estrechamente relacionada con el clado Ochotonidae que con el clado Leporidae (Fig. 3). En el análisis filogenético, el clado Prolagus-Ochotona se recupera con un 66% y un 73% de soporte de arranque de máxima probabilidad en la alineación con o sin la secuencia D-loop, respectivamente (Fig. 3). Los nodos relativos a los grupos basales de las dos familias existentes de lagomorfos (Ochotonidae y Leporidae) están fuertemente respaldados con valores de arranque del 100% como se esperaba, y el nodo basal para el género Lepus fue uno de los valores más altos dentro del grupo de Leporidae (66 %), así como el nudo basal del 63% agrupa la raíz del grupo Ochotona.

Árboles de máxima verosimilitud obtenidos con: (a) secuencias contig de ADNmt ribosómico (16S + 12S); (b) Secuencias de bucle D y cóntig ribosomal (bucle D + 16S + 12S). Los números de nodo representan valores de confianza. La longitud de las ramas es proporcional al número de sustituciones por sitio.

Los análisis del reloj molecular de los datos mitogenómicos obtenidos de P. sardus indicaron que divergió del linaje Ochotona hace aproximadamente 30 Ma (Fig. 4; Material complementario, Fig. S4). Nuestras estimaciones de divergencia entre los linajes Prolagus y Ochotona coinciden con las estimaciones derivadas de estudios paleontológicos previos49,50,51.

Fechas de divergencia e intervalos de confianza del 95% resultantes del análisis del modelo enraizado de ~ 51 Ma (bucle D parcial + conjunto de datos 12S parcial + 16S parcial) del método de datación molecular relajado bayesiano implementado en BEAST2.

Aquí presentamos la primera evidencia de conservación de ADN de un hueso de pika sarda Prolagus sardus, datado en el Neolítico, y recuperado en el yacimiento arqueológico de la cueva de Cabaddaris, en Cerdeña. La datación por radiocarbono del hueso analizado estuvo en línea con la edad estimada bruta esperada de los restos en esta cueva basada en investigaciones arqueológicas previas del sitio.

La autenticidad de los datos de la secuencia fue evidenciada por controles negativos limpios y patrones de daño al ADN, que no arrojan dudas sobre el origen antiguo de la información de la secuencia recuperada. La baja fracción de ADNa asignada a P. sardus que fue posible recuperar de este espécimen podría, sin embargo, confirmar las dificultades generales para recuperar ADN bien conservado de restos antiguos de la cálida cuenca mediterránea, en comparación con otros ambientes más fríos, como el permafrost12 ,52,53. Por lo tanto, en estas condiciones, normalmente se podrían recuperar de huesos antiguos muchas más copias del genoma mitocondrial que del genoma nuclear. Teniendo en cuenta que todas las secuencias de P. sardus que coinciden con las regiones codificantes del ADNmt utilizadas en los análisis filogenéticos no incluyeron ninguna mutación por desplazamiento del marco de lectura ni codones de parada que hubieran alterado los marcos de lectura abiertos, podemos excluir razonablemente que podrían pertenecer a secuencias de ADN mitocondrial presentes en el núcleo nuclear. genoma (NUMT) 12,54,55 y que, por lo tanto, lo que recuperamos podría considerarse derivado del verdadero ADNmt antiguo de P. sardus.

En general, al mapear lecturas de varias especies de lagomorfos de las cuales Ochotona curzoniae, O. princeps y Oryctolagus cuniculus representan aquellas con la mayor fracción de aciertos, recuperamos ~ 20% del genoma mitocondrial de P. sardus. Aunque la secuencia recuperada era solo aproximadamente una quinta parte del genoma mitocondrial total esperado, los datos de la secuencia antigua permitieron la primera ubicación filogenética molecular de esta especie extinta, como también se obtuvo para otras especies en estudios previos que utilizaron información parcial de la secuencia del ADNmt9,12.

Sólo dos familias existentes se reconocen en el orden Lagomorpha: Leporidae, que incluye los conejos, las liebres y las liebres; Ochotonidae, que incluye a las pikas, todos agrupados en el género monofilético Ochotona28,56,57,58. Estas dos familias divergieron hace aproximadamente 51,4 Ma59,60,61. Sin embargo, no existe un consenso comúnmente aceptado por la comunidad científica respecto a la distinción intraordinal del orden Lagomorpha cuando se consideran los grupos extintos20,62,63,64,65,66. Por el contrario, se han descrito varias familias extintas de Lagomorpha, incluidas †Paleolagidae Dice, 1929, †Mytonolagidae Burke, 1941, †Desmatolagidae Burke, 1941, †Prolagidae Gureev, 1962, †Mimolagidae Erbajeva, 1986 y †Strenulagidae Averianov y Lopatin, 200562 Además, otros autores propusieron diversas clasificaciones intraordinales del orden Lagomorpha23,67. La familia Prolagidae agrupa lagomorfos parecidos a pika reportados desde el Oligoceno-Mioceno más bajo hasta el Holoceno registros fósiles del área perimediterránea.

Los análisis filogenéticos que llevamos a cabo con las secuencias de P. sardus obtenidas se realizaron con un conjunto de datos de las correspondientes secuencias 12S, 16S y D-loop de ADNmt de especies modernas de Lagomorpha de diferentes continentes, utilizando el genoma mitocondrial de una especie de roedor como grupo externo. Como se esperaba, el análisis filogenético apoyó los nodos de las dos familias existentes con fuertes valores tanto para Leporidae como para Ochotonidae. Además, dentro de la familia Ochotonidae, las relaciones filogenéticas finas estaban en línea con estudios previos de este grupo de mamíferos basados ​​en los genes de ADNmt del citocromo b y ND470, lo que sugiere que la secuencia parcial de ADNmt utilizada en este estudio no omitió las microestructuras filogenéticas y las relaciones dentro del orden. .

Los árboles filogenéticos obtenidos con y sin la región D-loop fueron consistentes en apoyar la posición de P. sardus en un clado hermano de la familia Ochotonidae. El clado Prolagus-Ochotona se recuperó con buen respaldo estadístico en ambos análisis (66% y 73% de bootstrap en las dos reconstrucciones filogenéticas, es decir, con o sin la secuencia D-loop, respectivamente). En general, los valores de los nodos aumentaron con la adición de la secuencia del bucle D en la alineación, para todos los nodos de divergencia, mientras que este valor disminuyó para el nodo del linaje de P. sardus. Esto podría atribuirse principalmente a las diferentes proporciones de mutaciones presentes en esta región hipervariable71,72.

La datación molecular bayesiana implementada en BEAST destacó que P. sardus divergió de Ochotona spp. unos 30 Ma (CI: 15–59 Ma). Por lo tanto, nuestros análisis filogenéticos moleculares respaldan un escenario evolutivo independiente para el linaje Oligoceno-Holoceno Piezodus-Prolagus como lo sugirieron previamente los datos paleontológicos. Además, los datos disponibles apoyan la hipótesis de incluir el género Prolagus en la familia independiente Prolagidae. Por lo tanto, nuestros resultados pueden sugerir que un nuevo taxón que incluya a Prolagus puede explicar mejor la diversidad molecular encontrada y, a su vez, la diversidad morfológica descrita por los estudios paleontológicos, en línea con lo sugerido por algunos autores que utilizan únicamente información paleontológica23,24,25,26 ,27,28.

Este estudio proporciona la primera caracterización molecular sistemática de P. sardus, allanando el camino para su correcta asignación filogenética. Se necesitan más estudios para obtener una secuencia completa de ADNmt de esta especie extinta capaz de confirmar la datación molecular inferida. También se deberían investigar más especímenes de P. sardus para recuperar ADN de más individuos y comprender la diversidad intraespecífica de esta especie. También podría ser interesante evaluar la trayectoria evolutiva de esta especie a lo largo del tiempo analizando el ADN de otros especímenes datados en un amplio intervalo de tiempo y recuperados tanto en Cerdeña como en Córcega.

Una mandíbula de Prolagus sardus (PR6) excavada en el sitio arqueológico de la cueva de Cabaddaris (Lat. 40°08′46′′, Long. 3°00′45′′; Supramonte di Orgosolo, Nuoro) en Cerdeña (Italia) fue utilizado en este estudio (Fig. 1). La muestra fue recuperada en un yacimiento arqueológico del período Prenurágico de Cerdeña. Sin embargo, como no se disponía de datos estratigráficos claros, la muestra se envió para datación por radiocarbono. El hueso incluía el cuerpo mandibular completo y parte de la rama mandibular. El proceso condilar y la parte proximal del proceso coronoideo no se conservaron. La dentición estaba completa y el incisivo inferior y los dientes de la mejilla (P3-M2) estaban bien conservados. No se encontraron restos de otros lagomorfos en la cueva de Cabaddaris en asociación con esta mandíbula y los artefactos humanos. La muestra fue proporcionada por Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio per le Province di Sassari e Nuoro. La Soprintendenza representa los poderes territoriales del Gobierno, responsables de la gestión y la encomienda del patrimonio cultural en Italia.

Los análisis biomoleculares (p. ej. ADNa, paloeoproteómica) y físico-químicos (p. ej. isótopos, datación por radiocarbono) proporcionan información y datos fundamentales, aunque a menudo implican enfoques destructivos o microdestructivos. Para preservar preciosos restos antiguos, es importante aplicar, cuando sea posible, métodos apropiados de adquisición digital, con el objetivo de permitir análisis futuros o dejar la posibilidad de tener acceso a una reproducción del resto para fines museísticos. Así, se utilizó microfotogrametría para obtener un modelo gráfico 3D de la mandíbula antes de la extracción de ADN y la datación por radiocarbono (Fig. 1). Realizamos un total de 85 fotografías de alta resolución utilizando la cámara Olympus OM-D E-M10 MarkII con lentes digitales Olympus M. Zuiko ED de 12–50 mm a 0,36x (modo macro). Posteriormente, las imágenes se adquirieron y procesaron utilizando el software Agisoft Photoscan PRO (Agisoft, San Petersburgo, Rusia) fusionando nubes densas de cinco fragmentos diferentes y refinando manualmente el modelo obtenido hasta un total de 3000 puntos. El modelo 3D aquí obtenido está disponible en el repositorio de MorphoSource (https://www.morphosource.org/concern/media/000494910).

Para generar la datación por radiocarbono de los restos de Prolagus sardus, pesamos la mandíbula con una balanza de laboratorio de precisión (0,9 g). La muestra fue enviada al laboratorio del Centro de Datación y Diagnóstico del Departamento de Matemáticas y Física (CEDAD) de la Universidad de Salento (Italia) para su datación por radiocarbono, que se obtuvo con el Espectrometría de Masas con Acelerador (AMS) de CEDAD, siguiendo los métodos descritos previamente73 ,74. Se utilizaron muestras de referencia de concentración conocida de ácido oxálico proporcionadas por el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) como control de calidad de los resultados. Luego se calibró la datación por radiocarbono en la edad calendario utilizando OxCal Ver. 3.10 software basado en datos atmosféricos INTCAL2075.

La muestra PR6, representada por una mandíbula izquierda casi completa (Fig. 1), fue procesada en el Laboratorio de ADN Antiguo de la Universidad de Bolonia (Departamento de Patrimonio Cultural, Rávena, Italia). Se siguieron criterios estrictos establecidos para los análisis de ADNa para garantizar la autenticación de los datos y evitar contaminaciones76,77,78. De hecho, durante la manipulación de las muestras se utilizaron monos desechables, doble par de guantes, botas, mascarillas y protectores faciales de plástico. La encimera y los instrumentos se limpiaron regularmente después de cada experimento con una solución DNA Exitus Plus (AppliChem GmbH, Darmstadt, Alemania) o ~ 5% de NaClO comercial y se expusieron durante 30 minutos a radiación ultravioleta a 254 nm. Además, se utilizaron reactivos libres de ADN y se procesaron controles negativos para cada lote de muestras. Además, las reacciones de PCR y los procedimientos post-PCR se llevaron a cabo en un área físicamente aislada.

Se tomaron muestras y se agruparon los dientes, representados por un incisivo y los dientes de las mejillas, todos todavía encerrados en los alvéolos. Debido al pequeño tamaño de los dientes, no fue posible tomar muestra sólo de la parte de cemento. Se descontaminaron rociando hipoclorito de sodio entre 1,5 y 2,0 % sobre la superficie de los dientes y luego se utilizó una toalla de papel limpia, enjuagada con agua sin ADN, para eliminar la lejía. Posteriormente se secaron al aire durante un mínimo de 20 minutos bajo luz ultravioleta (UV) (longitud de onda de 254 nm) a una distancia de ~ 25 cm de la bombilla. Luego, se trituraron en un mortero y se recuperaron ~100 mg de polvo. La extracción de ADN se realizó utilizando una versión modificada de un protocolo de columna a base de sílice, agregando un paso de predigestión79,80,81. Se incluyó un control negativo de extracción en el proceso. Brevemente, el tampón de digestión estuvo compuesto por EDTA 0,45 M, proteinasa K 0,25 mg/mL, Tween al 0,05%, el tampón de unión fue el tampón PB (Qiagen, Hilden, Alemania) y las columnas de sílice fueron las de High Pure Viral Nucleic Acid Large. Kit de volumen (Roche, Basilea, Suiza). Se realizaron dos pasos de lavado con tampón PE (Qiagen) y finalmente el ADN se eluyó en 50 µl de tampón EB (Qiagen) y se cuantificó con el instrumento Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y el kit de ensayo de ADNds de alta sensibilidad (Thermo Fisher Científico).

Primero intentamos un protocolo de captura de secuencia de ADNmt multiplexado82 con cebos caseros obtenidos de PCR de largo alcance de ADN de Ochotona princeps, pero el enriquecimiento del ADNmt antiguo no tuvo éxito (datos no mostrados). Luego procedimos con un acercamiento de escopeta. Un total de 20 µl del material eluido se convirtieron en bibliotecas monocatenarias83 junto con una biblioteca como control negativo. El número óptimo de ciclos de PCR para la indexación se determinó mediante amplificación en tiempo real en el sistema de PCR ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific). La amplificación de indexación se realizó dividiendo 48 µl de cada biblioteca en dos reacciones de 50 µl durante 18 ciclos, utilizando un enfoque de indexación dual y AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Las bibliotecas amplificadas se purificaron utilizando perlas AMPure SPRI 0,9X (Beckman Coulter Life Sciences, Brea, CA, EE. UU.) y se cuantificaron en el bioanalizador (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) utilizando el kit DNA1000 (Agilent Technologies). Las bibliotecas indexadas de estas y otras muestras antiguas se agruparon en cantidades equimolares y se secuenciaron en un carril de una plataforma Illumina HiSeq X (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) para una secuenciación de extremos emparejados de 75 × 2, generando más de 32 millones de lecturas de pares.

Los datos sin procesar se investigaron inicialmente con FastQC84 para evaluar el rendimiento del proceso de secuenciación. Las secuencias se procesaron con Paleomix85 alineando lecturas de extremos emparejados con las versiones completas de siete genomas mitocondriales de diferentes especies: Sciurus vulgaris (número de acceso: NC_002369.1), Lepus capensis (GU937113), Mus musculus (NC_005089.1), Ochotona curzoniae. (NC_011029.1), O. princeps (NC_005358.1), Oryctolagus cuniculus (AJ001588.1) y Homo sapiens (NC_007092.1). Brevemente, los adaptadores se recortaron con parámetros indulgentes usando AdapterRemoval (número máximo de discrepancias permitidas al recortar códigos de barras ≤ 3, lecturas descartadas si la longitud es < 20). Para mejorar los mapeos de lecturas antiguas en los extremos de los genomas circulares de referencia, generamos versiones alargadas (valor de alargamiento k = 500) de los mitogenomas utilizando la herramienta CircularGenerator implementada en EAGER86. Las lecturas contraídas se alinearon inicialmente con las referencias alargadas utilizando el algoritmo de retroceso BWA, con una calidad mínima de lecturas alineadas ≥ 20 y el uso de la región semilla deshabilitado87. Luego, los archivos BAM preliminares se realinearon con la versión estándar de los mitogenomas de referencia utilizando la herramienta CircularMapper de EAGER. Los duplicados se eliminaron con PCRDuplicates en Paleomix85. Finalmente se estimó la autenticidad de los datos calculando frecuencias de C > T a lo largo de los extremos 5' y 3' de las lecturas con mapDamage288 y observando el número de lecturas alineadas con el genoma humano de referencia. Posteriormente, las secuencias con una profundidad mínima de 3X se inspeccionaron manualmente con Integrative Genomics Viewer (IGV)89 y se utilizaron para análisis adicionales. La reconstrucción de los cóntigos de ADNmt de P. sardus se obtuvo con GenomeVX90 utilizando la secuencia de referencia de ADNmt de O. curzoniae (número de acceso: NC_011029.1; 17.131 pb).

Las secuencias de Prolagus sardus obtenidas en este estudio se alinearon con 18 regiones de ADNmt 12S, 16S y D-loop publicadas previamente de especies modernas de Lagomorpha de diferentes continentes y una especie de Rodentia (Cricetulus griseus) como grupo externo. La lista de especies y la información relativa se muestran en la Tabla S1 de material complementario. La alineación se obtuvo utilizando MEGA X91, con la herramienta ClustalW. Se llevaron a cabo análisis filogenéticos en regiones filogenéticamente informativas del genoma del ADNmt (12S, 16S y D-loop) que se han establecido previamente para las dos familias de lagomorfos, Leporidae y Ochotonidae60,71,92. Se realizaron dos análisis filogenéticos utilizando la siguiente información de secuencia: (i) un contig obtenido uniendo tres secuencias ribosómicas parciales (dos contig de las regiones del gen 16S de 259 pb y 154 pb, respectivamente; y 1 contig de la región del gen 12S de 118 pb ) para un total de 531 pb de secuencia de ADNmt de P. sardus: (ii) a este cóntig, se añadió una porción de la secuencia del bucle D de 200 pb para obtener otro cóntig combinado de 731 pb de la secuencia del genoma mitocondrial de P. sardus . Los árboles de máxima verosimilitud se obtuvieron utilizando RAxML-NG93, proporcionando, para cada conjunto de datos, un árbol de unión de vecinos (NJ) inicial basado en la matriz de sustitución del modelo de Jukes y Cantor (JC)94, con 1000 bootstraps, como lo sugiere la herramienta “Modelos”. , implementado en MEGA X91. Se eligió el modelo más adecuado (JC) ya que mostraba la mejor probabilidad con y sin exogrupo (LnL -3021,9; LnL -20.647,8).

La estimación bayesiana del tiempo de divergencia entre P. sardus y otros taxones de Lagomorpha se obtuvo con BEAST 2.595 utilizando alineamientos de secuencias parciales de regiones de ADNmt D-loop, 16S y 12S ya utilizadas para los análisis filogenéticos. Se realizaron análisis de estimación bayesiana que incluyeron especies de las dos familias del orden Lagomorpha (Leporidae y Ochotonidae) y un grupo externo del orden Rodentia (Cricetulus griseus, número de acceso NC_007936.1). BEAST 2.5 se ejecutó asumiendo una combinación de parámetros que incluían un JC69, un modelo de sustitución Gamma4, un reloj molecular lognormal relajado y no correlacionado y un proceso de especiación de Yule91,96. Los siguientes tres puntos de calibración se definieron considerando una distribución Log normal: (i) la divergencia (ancestro común más reciente, MRCA) entre las familias Ochotonidae y Leporidae (51,4 Ma, IC 49,6–53,1)59,60,61; (ii) el nodo de divergencia del grupo Ochotona (12,2 Ma, CI 10,9–19,4)60,61; (iii) el nodo entre Romerolagus diazi y el género Lepus (17,6 Ma, CI 13,4–23,7)92,97. Los análisis se basaron en dos cadenas independientes de Markov Chain Monte Carlo (MCMC), cada una de las cuales consta de 10.000.000 de cadenas. Los datos se recopilaron cada 1000 puntos y el burn-in se estableció en un 10%. La convergencia de la cadena y los valores de tamaño de muestreo efectivo (ESS) superiores a 200 se evaluaron con Tracer v. 1.5 (disponible: http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer). TreeAnnotator v. 2.6.7 (Disponible: https://beast.community/treeannotator, consultado en 2022 Gen 1) y Figtree v. 1.4.4 (Disponible: http:// http://tree.bio.ed.ac. uk/software/figtree/, consultado el 1 de diciembre de 2021) se utilizaron para anotar e ilustrar los árboles finales.

Se realizó un análisis de reloj independiente aplicando el método RelTime disponible en el software MEGA X91,98,99. Las longitudes de las ramas se calcularon utilizando el método de máxima verosimilitud (ML) y se aplicó el modelo de sustitución de Jukes-Cantor100. Se aplicó una configuración de tipo de calibración de distribución logarítmica normal, con dos restricciones de calibración (nodo de divergencia Leporidae-Ochotona y nodo basal del género Ochotona) con el mismo tiempo utilizado para los análisis BEAST 2.5. Se utilizó el método de Tao et al.99 para establecer límites de tiempo mínimos y máximos en los nodos para los cuales se proporcionaron densidades de calibración y se calcularon intervalos de confianza con el mismo método100. Las barras alrededor de cada nodo representan intervalos de confianza del 95%. Se utilizó una distribución Gamma discreta para modelar las diferencias de tasas evolutivas entre taxones. La escala de tiempo geológico siguió Gradstein et al.101

El conjunto de datos de secuenciación generado y analizado durante el estudio actual está disponible en el repositorio del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/ena) con el registro de acceso del estudio PRJEB57248. El modelo 3D de la muestra está disponible en el repositorio de MorphoSource (https://www.morphosource.org/concern/media/000494910).

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Los autores agradecen a la Prof. Chiara Angelone (Universidad Roma Tre) por las sugerencias y comentarios al manuscrito y a la Dra. Caterinella Tuveri (Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio per le Province di Sassari e Nuoro) por proporcionar la muestra ósea de Prolagus sardus. Este trabajo se ha llevado a cabo en el contexto de la iniciativa LaGomiCs y COST Action RGB-Net: European Network on Rabbit Genome Biology (TD1101). Este trabajo fue apoyado por fondos RFO de la Universidad de Bolonia.

Departamento de Ciencias Agrícolas y Alimentarias, División de Ciencias Animales, Universidad de Bolonia, Viale Giuseppe Fanin 46, 40127, Bolonia, Italia

Valerio Joe Utzeri, Anisa Ribani, Samuele Bovo y Luca Fontanesi

Departamento de Patrimonio Cultural, Universidad de Bolonia, Via degli Ariani 1, 48121, Rávena, Italia

Elisabetta Cilli, Francesco Fontani, Adriana Latorre, Giorgio Gruppioni y Donata Luiselli

Departamento de Ciencias Químicas y Geológicas, Universidad de Cagliari, Cittadella Universitaria SS 554, 09042, Monserrato, Italia

Daniel Zoboli y Gian Luigi Pillola

Laboratorio de Ecología Microbiana, Istituto Zooprophylattico Sperimentale delle Venezie, Viale dell'Università 10, 35120, Legnaro, Italia

Massimiliano Orsini

AN Instituto Severtsov de Ecología y Evolución de la Academia de Ciencias de Rusia, Moscú, Rusia

Andrey A. Lissovsky

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VJU y LF concibieron el estudio. VJU, EC, LF y DL diseñaron los experimentos. VJU, EC, AR, AL, FF realizaron los experimentos. VJU, FF y EC analizaron los datos. VJU, FF y DZ prepararon figuras y/o tablas. DZ, MO, GLP, SB, GG y DL contribuyeron con reactivos/materiales/herramientas de análisis. LF, VJU, EC y DL escribieron o revisaron borradores del artículo. Todos los autores aprobaron el borrador final.

Correspondencia a Valerio Joe Utzeri, Elisabetta Cilli o Luca Fontanesi.

LF es miembro del consejo editorial de Scientific Reports. Los autores no declaran otros intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Utzeri, VJ, Cilli, E, Fontani, F et al. El ADN antiguo reabre la cuestión de la posición filogenética del pika sardo Prolagus sardus (Wagner, 1829), un lagomorfo extinto. Informe científico 13, 13635 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40746-w

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Recibido: 18 de marzo de 2023

Aceptado: 16 de agosto de 2023

Publicado: 21 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40746-w

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